همسانه‌سازی و انتقال ژن لوسیفراز حشره شبتاب گونه ایرانی Lampyris turkestanicus به گیاه توتون

نوع مقاله : علمی پژوهشی-فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی سابق کارشناسی‌ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس

2 دانشیار گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس

3 استادیار گروه زراعت و اصلاح نباتات،دانشکده کشاورزی،دانشگاه شهید چمران

4 دانشجوی کارشناسی‌ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی،دانشکده کشاورزی،دانشگاه تربیت مدرس

چکیده

" کشاورزی مولکولی" به تولید پروتئین‌های دارویی و آنزیم‌های صنعتی توسط گیاهان از طریق مهندسی ژنتیک اطلاق می‌شود. آنزیم لوسیفراز حشره شبتاب یکی از مهم ترین آنزیم‌های صنعتی است که به طور وسیعی در زمینه‌های مختلف بیوتکنولوژی و بیولوژی سلولی و مولکولی بویژه در تشخیص میزان ATP به منظور تشخیص آلودگی‌های میکروبی، تهیه کیت‌های تشخیص سرطان، غربالگری داروها، زیست‌حسگرها، همچنین در بررسی‌ روابط برهمکنشی و تاخوردگی پروتئین‌ها، سنجش‌های آنزیمی و توالی‌یابی DNA (Pyrosequencing) استفاده می‌شود. ژن لوسیفراز نیز به عنوان ژن گزارشگر ایده‌آل در مهندسی ژنتیک به منظور بهینه‌سازی سیستم انتقال ژن، کاربرد فراوان دارد. تحقیق حاضر جهت همسانه‌سازی، انتقال ژن لوسیفراز حشره شبتاب گونه ایرانی (Heyden)L. turkestanicus و تولید آن در گیاه توتون انجام گرفت. برای این منظور آغازگرهای مناسب با توجه به توالی‌های دو انتهای ژن لوسیفراز (luc)، محل‌های برشی مناسب و توالی‌ افزایش‌دهنده بیان گیاهی (Kozak sequence)طراحی و ژن مورد نظر پس از جداسازی، در ناقل بیانی pCAMBIA1304 همسانه‌سازی شد. این ژن تحت کنترل پیشبرنده CaMV35S و خاتمه‌دهنده NOS قرار دارد. به منظور اطمینان از همسانه‌سازی، سازه تهیه‌شده با استفاده از بررسی‌هایColonyPCR،PCR، هضم آنزیمی، توالی‌یابی و همردیف‌سازی آن در بانک اطلاعاتی (GenBank)، مورد تایید قرار گرفت. سپس سازه تهیه‌شده به کمک باکتری آگروباکتریوم سویه LBA4404 به گیاهان توتون منتقل گردید و گیاهان تراریخت بر روی محیط‌های کشت انتخابی حاوی آنتی‌بیوتیک‌های هیگرومایسین و سفوتاکسیم باززایی شدند. بررسی مولکولی PCRبا استفاده از آغازگرهای اختصاصی بر روی DNA ژنومی گیاهان تراریخت و شاهد، انتقال ژن لوسیفراز را به گیاهان باززایی‌شده تایید نمود.

عنوان مقاله [English]

Cloning and Transformation of Iranian Firefly Lampyris turkestanicus Luciferase Gene (luc) into Tobacco Plant

نویسندگان [English]

  • Babak Latif 1
  • Mokhtar Jalali Javaran 2
  • Hamid Rajabi Memari 3
  • Hamed Azhdari 4
1
2
3
4
چکیده [English]

“Molecular farming” is the use of plants, and potentially animals, as the means to produce therapeutic and industrial valuable proteins using genetic engineering techniques. Firefly luciferase is one of the most important industrial enzymes which has various applications in biotechnology and molecular biology such as microbial contamination detection by ATP amount, preparation of cancer diagnosis kits, drug screening, biosensors, protein folding and protein-protein interaction examinations, pyrosequencing, etc. luc is also used as an ideal reporter gene in order to optimize gene transformation systems in genetic engineering. In this study, Iranian firefly Lampyris turkestanicus luciferase gene (luc) was cloned and introduced into tobacco plants. The gene was isolated by PCR and appropriate primers, designated according to luc termini, restriction sites and a plant highly expression sequence (Kozak sequence), and then cloned in pCAMBIA1304 vector, under the control of CaMV35S promoter and NOS terminator. The construct was confirmed by several methods: colony PCR, PCR, digestion, sequencing and BLAST analysis. The Agrobacterium–mediated transformation method was used to introduce luc into tobacco genome and putative transgenic plants were selected on the selective medium containing hygromycin and cefotaxim. Finally, transgenic plants were confirmed by PCR analysis on transgenic and control plants’ genomic DNA.